Mutacja aktywująca GPR54 u pacjenta z centralnym przedwczesnym okresem dojrzewania cd

Genomowy DNA ekstrahowano z leukocytów krwi obwodowej, a cały region kodujący, jak również granice egzon-intron GPR54 (numer dostępu w GenBank, NM_032551) amplifikowano i sekwencjonowano w zautomatyzowanym sekwenserze.8. Generacja Arg386Pro GPR54 poprzez mutagenezę ukierunkowaną na lokalizację
Mutant Arg386Pro GPR54 wytworzono in vitro za pomocą ukierunkowanej mutagenezy z zestawem do kierowania na stronę QuikChange II (Stratagene) i ssaczym wektorem ekspresyjnym pCMVsport6, zawierającym GPR54 pełnej długości dziki ludzki jako matrycę.8 potwierdził obecność mutacji za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania.
Badania nad sygnalizacją GPR54
Komórki nerki-fibroblasty z zielonej małpy afrykańskiej (komórki COS-7) przejściowo transfekowano 50 ng GPR54 typu dzikiego, Arg386Pro GPR54 lub pustym wektorem (pCMVsport6), stosując odczynnik GenePORTER Transfection Reagent (Gene Therapy Systems). Całkowity fosforan inozytolu i fosforylacja pozakomórkowej kinazy regulowanej sygnałem mierzono w różnych punktach po stymulacji wzrastającymi poziomami kisspeptyny15. (Szczegółowe informacje znajdują się w sekcji Metody dodatku dodatkowego).
Wyniki
Analiza DNA
Rysunek 1. Rysunek 1. Sekwencje dzikiego typu i mutanta GPR54. Sekwencja cytozyna-guanina-cytozyna typu dzikiego (CGC) typu dzikiego w eksonie GPR54 koduje argininę (R) w kodonie 386 (R386). Heterozygotyczna substytucja C dla G (pokazana dla naszego pacjenta ze strzałką) powoduje podstawienie proliny (P) dla R (R386P) w końcu karboksylowym białka (pokazane w błonie komórkowej). W sekwencjach nukleotydowych (pokazanych bezpośrednio pod dwoma wykresami) T oznacza nukleotyd tymidynę.
Zautomatyzowane sekwencjonowanie genomowego DNA pacjenta dla GPR54 ujawniło heterozygotyczne podstawienie cytozyny dla guaniny w pozycji nukleotydowej 1157 w eksonie 5, czego wynikiem było podstawienie proliny dla argininy w kodonie 386 (Arg386Pro) w końcu karboksylowym receptora (fig. 1). Mutacja Arg386Pro generuje miejsce restrykcyjne rozpoznawane przez SmaI; mutacja została przebadana na 300 chromosomach od 150 etnicznie dobranych kontrolnych, którzy mieli historię normalnego rozwoju płciowego oraz w 106 chromosomach z 53 niespokrewnionych dzieci (50 dziewcząt i 3 chłopców), którzy mieli idiopatyczne centralne przedwczesne dojrzewanie. Mutacja Arg386Pro była nieobecna we wszystkich kontrolach, jak również u niespokrewnionych pacjentów z przedwczesnym dojrzewaniem.
Analiza funkcjonalna Arg386Pro GPR54
Badania wiązania przeprowadzone w komórkach COS-7 transfekowanych dzikiego typu lub Arg386Pro GPR54 i inkubowane z znakowaną 125I kisspeptyną nie wykazały znaczącego wpływu podstawienia aminokwasu na powinowactwo wiązania kisspeptyny lub poziomy ekspresji GPR54 (stała dysocjacji dla dzikich zwierząt typ GPR54, 4,4 nM, dla Arg386Pro GPR54, 7,0 nM, maksymalna zdolność wiązania dla obu typów GPR54, 20 nmoli na miligram białka) (ryc. S1 w dodatku uzupełniającym).
Ryc. 2. Ryc. 2. Pobudzona kisspeptyną produkcja fosforanu inozytolu w komórkach COS-7 transfekowanych GPR54 typu dzikiego lub Arg386Pro GPR54. Całkowitą akumulację fosforanu inozytolu mierzono w zliczeniach na minutę (cpm) 45 minut po stymulacji 10-11 do 10-7 M kisspeptyny-10 (panel A)
[hasła pokrewne: kaufland wejherowo godziny otwarcia, paryżanka allegro, zdjęcie zęba ]

Powiązane tematy z artykułem: kaufland wejherowo godziny otwarcia paryżanka allegro zdjęcie zęba